docs(validation): add macrolactone fragmentation report

scripts/analyze_validation_fragment_library.py

@@ -3,6 +3,7 @@ from __future__ import annotations
 import argparse
 from math import ceil
 from pathlib import Path
+import sqlite3
 
 import matplotlib
 
@@ -448,6 +449,48 @@ def format_position_mapping(positions: list[int], ring_size: int) -> str:
     return ", ".join(f"{position} → {mirror_ring_position(position, ring_size)}" for position in positions)
 
 
+def build_zero_fragment_parent_table(db_path: str | Path, ring_size: int) -> pd.DataFrame:
+    with sqlite3.connect(db_path) as connection:
+        tables = {
+            row[0]
+            for row in connection.execute(
+                "SELECT name FROM sqlite_master WHERE type='table'"
+            )
+        }
+        if "fragment_library_entries" in tables:
+            query = """
+                SELECT ml_id, num_sidechains, cleavage_positions
+                FROM parent_molecules
+                WHERE classification = 'standard_macrolactone'
+                  AND ring_size = ?
+                  AND processing_status = 'success'
+                  AND NOT EXISTS (
+                      SELECT 1
+                      FROM fragment_library_entries fle
+                      WHERE fle.source_parent_ml_id = parent_molecules.ml_id
+                        AND fle.source_type = 'validation_extract'
+                        AND fle.splice_ready = 1
+                  )
+                ORDER BY ml_id
+            """
+        else:
+            # The lightweight test database only includes parent_molecules.
+            query = """
+                SELECT ml_id, num_sidechains, cleavage_positions
+                FROM parent_molecules
+                WHERE classification = 'standard_macrolactone'
+                  AND ring_size = ?
+                  AND processing_status = 'success'
+                  AND num_sidechains = 0
+                ORDER BY ml_id
+            """
+        return pd.read_sql_query(
+            query,
+            connection,
+            params=[ring_size],
+        )
+
+
 def build_markdown_report(
     output_dir: Path,
     analysis_df: pd.DataFrame,
@@ -655,6 +698,8 @@ def build_markdown_report_zh(
     ring_df: pd.DataFrame,
     filtered_ring_df: pd.DataFrame,
     filter_candidates: pd.DataFrame,
+    standard_success_parent_count: int,
+    zero_fragment_ring_parents: pd.DataFrame,
     diversity_gt3: pd.DataFrame,
     position_counts: pd.DataFrame,
     ring_sensitivity_table: pd.DataFrame,
@@ -688,8 +733,20 @@ def build_markdown_report_zh(
         "",
         f"- 当前验证后的可拼接碎片库包含 **{len(analysis_df):,}** 条片段记录，来源于 **{analysis_df['source_parent_ml_id'].nunique():,}** 个母体分子。",
         f"- 其中 {ring_size} 元环子集包含 **{len(ring_df):,}** 条片段记录，来源于 **{ring_df['source_parent_ml_id'].nunique():,}** 个母体分子。",
+        f"- 这里的“可拼接碎片”指验证库中 `source_type='validation_extract'` 且 `splice_ready=1` 的单锚点侧链片段。桥环、稠环或任何具有多个环连接点的侧链都已经在生成阶段被排除，不会进入这份库。",
+        f"- 16 元环子集是按母体元数据里的 `ring_size=16` 直接过滤出来的，不是从片段反推 ring size。",
         f"- 用于设计相关位点分析的严格子集定义为：片段重原子数 **>= {design_min_atoms}**。",
         "",
+        "## 16 元环母体计数口径说明",
+        "",
+        f"- 在数据库里，`standard_macrolactone + ring_size={ring_size} + processing_status=success` 一共有 **{standard_success_parent_count:,}** 个母体。",
+        f"- 其中 **{ring_df['source_parent_ml_id'].nunique():,}** 个母体至少产出过 1 条可拼接片段，所以进入了当前报告的 16 元环片段统计。",
+        f"- 剩余 **{len(zero_fragment_ring_parents):,}** 个母体没有任何可拼接片段；它们的共同特征是 `num_sidechains=0`、`cleavage_positions=[]`。",
+        "",
+        "```text",
+        zero_fragment_ring_parents.to_string(index=False) if not zero_fragment_ring_parents.empty else "No zero-fragment parents.",
+        "```",
+        "",
         "## 全库碎片大小结论",
         "",
         f"- 默认清洗阈值建议使用 `<= {design_min_atoms - 2}` 重原子删除。该阈值会删除 **{int(conservative_filter.removed_rows):,}** 条记录（{conservative_filter.removed_row_fraction:.1%}），但仅删除 **{int(conservative_filter.removed_unique_fragments):,}** 个唯一片段（{conservative_filter.removed_unique_fraction:.1%}）。",
@@ -730,7 +787,7 @@ def build_markdown_report_zh(
         "",
         "## 桥环 / 稠环干扰的敏感性分析",
         "",
-        "桥连或双锚点侧链不会进入当前片段库，因为断裂逻辑只保留与主环存在 **1 个连接点** 的侧链组件。也就是说，真正的 bridge / fused multi-anchor components 已被代码层面排除。",
+        "桥连或双锚点侧链不会进入当前片段库，因为断裂逻辑只保留与主环存在 **1 个连接点** 的侧链组件。也就是说，真正的 bridge / fused multi-anchor components 已被代码层面排除。上面那 6 个 16 元环母体并不是这类“被误收进来的桥环碎片”，而是根本没有任何可拼接外侧链，所以不会产生 fragment 行。",
         "",
         "但是，需要额外区分另一类情况：**cyclic single-anchor side chains**。这类片段虽然只在一个位置连到主环，因此会被保留下来，但片段自身可能包含糖环、杂环或其他环状骨架，仍然会显著影响位点多样性排名。",
         "",
@@ -905,6 +962,21 @@ def main(argv: list[str] | None = None) -> None:
     ].copy()
     ring_df = analysis_df[analysis_df["ring_size"] == args.ring_size].copy()
     filtered_ring_df = ring_df[ring_df["fragment_atom_count"] >= args.design_min_atoms].copy()
+    zero_fragment_ring_parents = build_zero_fragment_parent_table(args.db, args.ring_size)
+    with sqlite3.connect(args.db) as connection:
+        standard_success_parent_count = int(
+            pd.read_sql_query(
+                """
+                SELECT COUNT(*) AS count
+                FROM parent_molecules
+                WHERE classification = 'standard_macrolactone'
+                  AND ring_size = ?
+                  AND processing_status = 'success'
+                """,
+                connection,
+                params=[args.ring_size],
+            ).iloc[0]["count"]
+        )
 
     if analysis_df.empty:
         raise ValueError("No splice-ready standard macrolactone fragments available for analysis.")
@@ -1003,6 +1075,8 @@ def main(argv: list[str] | None = None) -> None:
         ring_df,
         filtered_ring_df,
         filter_candidates,
+        standard_success_parent_count,
+        zero_fragment_ring_parents,
         diversity_gt3,
         position_counts,
         ring_sensitivity,

validation_output/fragment_library_analysis/fragment_library_analysis_report_zh.md

@@ -1,11 +1,205 @@
 # 大环内酯碎片库分析报告（中文）
 
+## 数据筛选流程图
+
+下面这张图把本报告里的数据是如何一步步筛出来的串起来。它分成两段：
+
+- 第一段是 `validation` 阶段，负责把原始 MacrolactoneDB 母体变成 `fragment_library.csv`
+- 第二段是 `fragment_library_analysis` 阶段，负责从 `fragment_library.csv` 里统计出本报告里的 34,829、4,451、8,108、1,105 等数字
+
+```mermaid
+flowchart TD
+    A["原始输入 CSV<br/>/Users/lingyuzeng/project/macro_split/data/MacrolactoneDB/ring12_20/temp.csv"] --> B["stratified_sample_by_ring_size()<br/>按 12-20 元环分层抽样 10%"]
+    B --> C["classify_macrocycle()<br/>只保留 standard_macrolactone"]
+    C -->|non_standard_macrocycle / not_macrolactone| C1["processing_status = skipped<br/>不进入裂解"]
+    C -->|standard_macrolactone| D["find_macrolactone_candidates()<br/>确认主环候选"]
+    D --> E["number_macrolactone()<br/>建立 canonical numbering"]
+    E --> F["遍历 position > 2 的环位点"]
+    F --> G["跳过 ring atom<br/>跳过 intrinsic lactone neighbor"]
+    G --> H["collect_fragmentable_side_chain_atoms()<br/>只保留可拼接单锚点侧链"]
+    H -->|None| H1["丢弃该邻居/该裂解尝试"]
+    H -->|atoms returned| I["build_fragment_with_isotope()<br/>生成同位素标记碎片"]
+    I --> J["Chem.MolFromSmiles(plain_smiles)<br/>SMILES 必须有效"]
+    J -->|invalid| J1["丢弃该碎片"]
+    J -->|valid| K["写入 SideChainFragment"]
+    K --> L["写入 FragmentLibraryEntry<br/>source_type='validation_extract'<br/>splice_ready=True"]
+    L --> M["parent.processing_status = success<br/>num_sidechains += 1"]
+    M --> N["导出 fragment_library.csv / summary.csv / fragments.db"]
+    N --> O["load_fragment_library_dataset()<br/>把 fragment_library.csv 与 parent_molecules 合并"]
+    O --> P["annotate_fragment_atom_counts()<br/>按 plain SMILES 计算重原子数"]
+    P --> Q["build_fragment_atom_count_summary()<br/>得到 34,829 / 4,451 / 1,852"]
+    P --> R["build_position_diversity_table()<br/>得到位点统计表"]
+    P --> S["ring_size=16 过滤<br/>得到 8,108 条片段、1,105 个母体"]
+    S --> T["> 3 重原子过滤<br/>得到设计相关子集与位点多样性结论"]
+```
+
+这张流程图对应的是一条从“原始母体”到“最终碎片统计”的两段式筛选链路。这里的“原始输入 CSV”指的是传入 `validator.run(input_csv)` 的 MacrolactoneDB ring12_20 数据集文件，在当前仓库里的默认入口脚本 [scripts/validate_macrolactone_db.py](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/scripts/validate_macrolactone_db.py) 中，默认值就是 `data/MacrolactoneDB/ring12_20/temp.csv`，对应的绝对路径是 `/Users/lingyuzeng/project/macro_split/data/MacrolactoneDB/ring12_20/temp.csv`。第一段发生在 `validation` 阶段：程序先读取这个输入 CSV，对所有分子做 `classify_macrocycle()` 预分类，并按 12 到 20 元环分层抽样。这里的“抽 10%”不是对整个数据集一次性随机抽样，而是先按 `_ring_size` 把分子分到 12、13、14、15、16、17、18、19、20 这九个层级，再对每个层级分别抽取 `max(1, int(len(group) * sample_ratio))` 条记录；`sample_ratio` 的默认值是 `0.1`，`random_state` 的默认值是 `42`。抽样之后，只有被识别为 `standard_macrolactone` 的分子才会继续处理；`non_standard_macrocycle` 和 `not_macrolactone` 会直接被标记为 `skipped`，不会进入裂解步骤。对标准大环内酯，程序先用 `find_macrolactone_candidates()` 确认主环候选，再用 `number_macrolactone()` 建立 canonical numbering，之后只遍历 `position > 2` 的环位点。对于每个位点，代码会跳过环内原子和 intrinsic lactone neighbor，只对真正位于外侧链上的邻居进行处理；随后通过 `collect_fragmentable_side_chain_atoms()` 判断这段侧链是否满足“单锚点、可拼接”的要求。如果该函数返回 `None`，说明这条侧链不符合拼接条件，整次裂解尝试就会被丢弃。若侧链可拼接，则继续用 `build_fragment_with_isotope()` 生成同位素标记碎片，并用 `Chem.MolFromSmiles(plain_smiles)` 做一次有效性检查；只有 SMILES 能被正确解析的碎片才会被写入 `SideChainFragment` 和 `FragmentLibraryEntry`。在写入统一碎片库时，这些记录会被固定标记为 `source_type='validation_extract'` 和 `splice_ready=True`，表示它们是后续拼接设计可以直接使用的碎片。母体记录则会被回写为 `processing_status = success`，并记录该分子实际产生了多少条侧链碎片以及对应的裂解位点。
+
+第二段发生在 `fragment_library_analysis` 阶段：分析脚本只读取已经生成好的 `fragment_library.csv`，再从 SQLite 数据库中读取 `parent_molecules` 表，把 `source_parent_ml_id` 和 `ml_id` 对齐后合并母体元数据。这个合并步骤的作用是把每条碎片重新挂回到它来自哪个母体、属于哪种分类、对应哪个环大小以及母体是否成功处理等信息上；如果有任何碎片在数据库里找不到对应母体，分析会直接报错，而不会静默继续。合并完成后，脚本会根据 `fragment_smiles_plain` 计算重原子数，形成后续所有统计的基础字段。全库的 `34,829` 条记录和 `4,451` 个去重母体，就是在这一步对 `fragment_library_entries` 做总量统计得到的；随后再按 `ring_size=16` 过滤，就得到 16 元环子集的 `8,108` 条碎片记录和 `1,105` 个母体。接下来如果进一步应用 `>= 4` 重原子的设计相关过滤，就会得到用于位点多样性分析的严格子集；`build_position_diversity_table()` 就是在这个子集上按 `cleavage_position` 分组，统计每个位点的总碎片数、唯一碎片数、香农熵、Tanimoto 距离和原子数分布，从而得出本报告里 16 元环位点排序和热点结论。
+
+### 标准大环内酯的识别规则
+
+这里再单独把“标准环怎么判”的逻辑说清楚，因为这是整个筛选链路的根。
+
+- 入口是 [analyzer.py](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/src/macro_lactone_toolkit/analyzer.py#L19-L26) 调用 [\_core.py](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/src/macro_lactone_toolkit/_core.py#L89-L137) 里的 `classify_macrolactone()`
+- `find_macrolactone_candidates()` 会遍历 `mol.GetRingInfo().AtomRings()`，只保留环长在 `12..20` 的候选环
+- 每个候选环都必须能找到一个乳内酯特征：
+  - 1 个羰基碳
+  - 1 个酯氧
+  - 能组成 lactone ring 的闭环
+- 如果找不到任何 12-20 元 lactone ring，就会被判为 `not_macrolactone`
+- 如果找到多个彼此重叠的候选环，就会被判为 `non_standard_macrocycle`，这是桥环、稠环或多环重叠结构的主要排除门槛
+- 如果候选环唯一，再调用 `build_numbering_result()` 建立编号，随后检查 `3..N` 位是否存在非碳原子：
+  - 只要环上除 1、2 位以外出现了 O、N 等非 C 原子，就会被判为 `non_standard_macrocycle`
+  - 对应的原因码是 `contains_non_carbon_ring_atoms_outside_positions_1_2`
+- 只有“候选环唯一 + 3..N 全为碳 + 环长在 12-20”同时成立时，才会被判为 `standard_macrolactone`
+
+这也解释了你提到的两类结构：
+
+- **环肽/非标准大环**：如果环上 3..N 出现 N、O 等非碳原子，虽然可能也是大环，但不会进入标准大环内酯集合
+- **桥环/稠环**：如果一个分子里存在多个重叠的 lactone 候选环，程序会直接把它归为 `non_standard_macrocycle`，不会进入后续裂解
+
+### 口径对照
+
+- `34,829` 是最终 `fragment_library_entries` 中的总行数，不是原始输入总分子数
+- `4,451` 是这 34,829 条片段对应的去重母体数
+- `4,482` 是 `summary.csv` / 数据库里所有 `standard_macrolactone + success` 母体数
+- 两者之差 `31` 个母体，是已经成功识别为标准大环内酯、但 `num_sidechains=0`，因此没有产生任何可拼接片段的分子
+- `1,111` 是 `standard_macrolactone + ring_size=16 + success` 母体数
+- `1,105` 是其中至少产出 1 条可拼接片段的 16 元环母体数
+- 两者之差 `6` 个母体，也是没有任何可拼接外侧链的 16 元环分子
+
+## 分步筛选说明（对应代码）
+
+### 1. 输入与分层抽样
+
+- 入口在 [validator.py](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/src/macro_lactone_toolkit/validation/validator.py#L38-L67) 的 `run()`
+- 原始输入先读成 `DataFrame`
+- 然后调用 [sampling.py](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/src/macro_lactone_toolkit/validation/sampling.py#L8-L60) 里的 `stratified_sample_by_ring_size(df, self.sample_ratio, self.smiles_col)`
+- 这一步先对所有分子做 `classify_macrocycle()` 预分类，再按 `_ring_size` 在 `12..20` 各层分别抽样
+- 默认 `sample_ratio=0.1`，`random_state=42`
+- 这一步的意义是：按 12-20 元环大小分层抽样，而不是对整个库做一次性随机抽样
+
+### 2. 母体分类
+
+- 入口在 [validator.py](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/src/macro_lactone_toolkit/validation/validator.py#L72-L146) 的 `_process_molecule()`
+- 用 `self.analyzer.classify_macrocycle(smiles)` 把分子分成三类：
+  - `standard_macrolactone`
+  - `non_standard_macrocycle`
+  - `not_macrolactone`
+- 只有 `standard_macrolactone` 会进入后续裂解
+- 其他两类直接设为 `processing_status = skipped`
+
+### 3. 标准大环内酯的候选确认与编号
+
+- 入口在 [validator.py](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/src/macro_lactone_toolkit/validation/validator.py#L148-L186)
+- 先调用 `find_macrolactone_candidates(mol, ring_size=parent.ring_size)` 找主环候选
+- 如果候选为空，或同一分子里出现多个无法唯一确定的候选，会报错或终止
+- 然后调用 `number_macrolactone(mol, ring_size=parent.ring_size)` 建立 canonical numbering
+- 这里的编号规则就是本仓库统一规则：`1 = 内酯羰基碳`，`2 = 相邻酯氧`，`3..N` 顺着环唯一遍历
+
+### 4. 逐位点裂解
+
+- 入口仍在 [validator.py](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/src/macro_lactone_toolkit/validation/validator.py#L187-L264)
+- 循环只看 `position > 2` 的环位点，`1` 和 `2` 不参与裂解
+- 对每个位点：
+  - 先取该位点的环原子
+  - 再遍历其邻居
+  - 若邻居还是环内原子，则跳过
+  - 若是 intrinsic lactone neighbor，也跳过
+- 剩下的邻居才进入 `collect_fragmentable_side_chain_atoms(...)`
+
+### 5. 侧链可拼接性过滤
+
+- 这一步是最关键的筛选门槛，代码仍在 [validator.py](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/src/macro_lactone_toolkit/validation/validator.py#L206-L214)
+- `collect_fragmentable_side_chain_atoms(...)` 必须返回一个有效的原子集合
+- 如果返回 `None`，说明该侧链不满足“可拼接单锚点侧链”的条件，直接丢弃
+- 这也是桥环、稠环、双锚点或其他不可拼接外侧链被排除的核心位置
+
+### 6. 碎片构建与有效性检查
+
+- 入口在 [validator.py](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/src/macro_lactone_toolkit/validation/validator.py#L216-L228)
+- 用 `build_fragment_with_isotope(...)` 生成：
+  - `fragment_smiles_labeled`
+  - `fragment_smiles_plain`
+  - `original_bond_type`
+- 接着用 `Chem.MolFromSmiles(plain_smiles)` 再做一次有效性检查
+- 如果 plain SMILES 无法解析，这条碎片也会被丢弃
+
+### 7. 写入片段库
+
+- 入口在 [validator.py](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/src/macro_lactone_toolkit/validation/validator.py#L230-L264)
+- 每条通过筛选的碎片都会写入两个表：
+  - `SideChainFragment`
+  - `FragmentLibraryEntry`
+- 其中 `FragmentLibraryEntry` 固定写入：
+  - `source_type='validation_extract'`
+  - `splice_ready=True`
+  - `dummy_atom_count=1`
+- 也就是说，进入本报告的都是已经被判定为“可直接用于单锚点拼接”的碎片
+
+### 8. 母体状态回写
+
+- 入口在 [validator.py](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/src/macro_lactone_toolkit/validation/validator.py#L273-L279)
+- 处理完成后，母体会被标记为 `processing_status = success`
+- 同时写回：
+  - `num_sidechains = len(fragments)`
+  - `cleavage_positions = [...]`
+- 如果标准大环内酯没有任何可拼接侧链，母体仍然会是 `success`，但 `num_sidechains=0`
+
+### 9. 统一导出
+
+- 入口在 [validator.py](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/src/macro_lactone_toolkit/validation/validator.py#L280-L383)
+- 这一步导出三类关键文件：
+  - `summary.csv`
+  - `summary_statistics.json`
+  - `fragment_library.csv`
+- 其中本报告使用的核心输入是 `fragment_library.csv` 和数据库里的 `parent_molecules`
+
+### 10. 报告统计
+
+- 入口在 [fragment_library_analysis.py](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/src/macro_lactone_toolkit/validation/fragment_library_analysis.py#L44-L69)
+- `load_fragment_library_dataset()` 会：
+  - 读取 `fragment_library.csv`
+  - 从 SQLite 里读取 `parent_molecules`
+  - 按 `source_parent_ml_id = ml_id` 合并
+  - 校验母体元数据不能缺失
+- 然后 `annotate_fragment_atom_counts()` 会按 `fragment_smiles_plain` 计算重原子数
+
+### 11. 汇总输出
+
+- 入口在 [fragment_library_analysis.py](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/src/macro_lactone_toolkit/validation/fragment_library_analysis.py#L72-L183)
+- `build_fragment_atom_count_summary()` 生成全库统计，得到本报告中的：
+  - `rows = 34,829`
+  - `unique_parent_molecules = 4,451`
+  - `unique_fragment_smiles = 1,852`
+- `build_filter_candidate_table()` 生成阈值删除表，因此报告里能看到 `<= 2`、`<= 3`、`<= 4` 等过滤候选
+- `build_position_diversity_table()` 生成位点多样性表，因此报告里能看到 16 元环的位点排序与 `> 3` 重原子子集结论
+
 ## 数据范围
 
 - 当前验证后的可拼接碎片库包含 **34,829** 条片段记录，来源于 **4,451** 个母体分子。
 - 其中 16 元环子集包含 **8,108** 条片段记录，来源于 **1,105** 个母体分子。
+- 这里的“可拼接碎片”指验证库中 `source_type='validation_extract'` 且 `splice_ready=1` 的单锚点侧链片段。桥环、稠环或任何具有多个环连接点的侧链都已经在生成阶段被排除，不会进入这份库。
+- 16 元环子集是按母体元数据里的 `ring_size=16` 直接过滤出来的，不是从片段反推 ring size。
 - 用于设计相关位点分析的严格子集定义为：片段重原子数 **>= 4**。
 
+## 16 元环母体计数口径说明
+
+- 在数据库里，`standard_macrolactone + ring_size=16 + processing_status=success` 一共有 **1,111** 个母体。
+- 其中 **1,105** 个母体至少产出过 1 条可拼接片段，所以进入了当前报告的 16 元环片段统计。
+- 剩余 **6** 个母体没有任何可拼接片段；它们的共同特征是 `num_sidechains=0`、`cleavage_positions=[]`。
+
+```text
+     ml_id  num_sidechains cleavage_positions
+ML00006860               0                 []
+ML00007029               0                 []
+ML00007030               0                 []
+ML00007031               0                 []
+ML00007032               0                 []
+ML00008015               0                 []
+```
+
 ## 全库碎片大小结论
 
 - 默认清洗阈值建议使用 `<= 2` 重原子删除。该阈值会删除 **28,069** 条记录（80.6%），但仅删除 **26** 个唯一片段（1.4%）。
@@ -41,7 +235,7 @@
 
 ## 桥环 / 稠环干扰的敏感性分析
 
-桥连或双锚点侧链不会进入当前片段库，因为断裂逻辑只保留与主环存在 **1 个连接点** 的侧链组件。也就是说，真正的 bridge / fused multi-anchor components 已被代码层面排除。
+桥连或双锚点侧链不会进入当前片段库，因为断裂逻辑只保留与主环存在 **1 个连接点** 的侧链组件。也就是说，真正的 bridge / fused multi-anchor components 已被代码层面排除。上面那 6 个 16 元环母体并不是这类“被误收进来的桥环碎片”，而是根本没有任何可拼接外侧链，所以不会产生 fragment 行。
 
 但是，需要额外区分另一类情况：**cyclic single-anchor side chains**。这类片段虽然只在一个位置连到主环，因此会被保留下来，但片段自身可能包含糖环、杂环或其他环状骨架，仍然会显著影响位点多样性排名。
 
@@ -110,4 +304,3 @@
 - 16 元环位点多样性图：`ring16_position_diversity_gt3.png`
 - 16 元环桥环/带环侧链敏感性图：`ring16_position_ring_sensitivity.png`
 - 16 元环药化热点对比图：`ring16_medchem_hotspot_comparison.png`
-

validation_output/macrolactone_validation_fragmentation_enumeration_report_zh.md

@@ -0,0 +1,380 @@
+# MacrolactoneDB 验证、碎片库分析与 Tylosin 枚举报告
+
+本文档把 `temp.csv` 的验证筛选、侧链碎片库生成、碎片大小分析、16 元环位点提取，以及 tylosin 枚举结果串成一条完整数据链路。目标是让没有上下文的读者也能直接理解：
+
+1. 原始数据如何从 11,036 个分子收缩到标准大环内酯集合。
+2. 为什么最终碎片库只有 4,451 个母体进入可拼接片段分析。
+3. 为什么后续侧链筛选采用 `>3` 重原子作为下限。
+4. 16 元环的 `3/4/12/13` 位点碎片是如何导出并用于 tylosin 枚举的。
+
+## 结果文件一览
+
+| 文件 | 作用 |
+|---|---|
+| [validation_output/summary.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/summary.csv) | 逐分子验证结果与 `processing_status` |
+| [validation_output/summary_statistics.json](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/summary_statistics.json) | 验证统计汇总 |
+| [validation_output/fragments.db](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragments.db) | 验证阶段 SQLite 数据库 |
+| [validation_output/fragment_library.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library.csv) | 统一碎片库导出 |
+| [validation_output/fragment_library_analysis/fragment_atom_count_summary.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library_analysis/fragment_atom_count_summary.csv) | 碎片原子数概览，含最大值 |
+| [validation_output/fragment_library_analysis/fragment_atom_count_frequency.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library_analysis/fragment_atom_count_frequency.csv) | 原子数频率分布 |
+| [validation_output/fragment_library_analysis/fragment_atom_count_filter_candidates.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library_analysis/fragment_atom_count_filter_candidates.csv) | 不同下限阈值的删减效果 |
+| [validation_output/fragment_library_analysis/analysis_summary.txt](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library_analysis/analysis_summary.txt) | 文字版分析摘要 |
+| [validation_output/ring16_position_fragment_exports/pos3_fragments_dedup.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/ring16_position_fragment_exports/pos3_fragments_dedup.csv) | 16 元环 3 位碎片库 |
+| [validation_output/ring16_position_fragment_exports/pos4_fragments_dedup.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/ring16_position_fragment_exports/pos4_fragments_dedup.csv) | 16 元环 4 位碎片库 |
+| [validation_output/ring16_position_fragment_exports/pos12_fragments_dedup.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/ring16_position_fragment_exports/pos12_fragments_dedup.csv) | 16 元环 12 位碎片库 |
+| [validation_output/ring16_position_fragment_exports/pos13_fragments_dedup.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/ring16_position_fragment_exports/pos13_fragments_dedup.csv) | 16 元环 13 位碎片库 |
+| [validation_output/enumeration/per_scaffold/tylosin/scheme_b_fix_pos13/tylosin_scheme_b_unique_products.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/enumeration/per_scaffold/tylosin/scheme_b_fix_pos13/tylosin_scheme_b_unique_products.csv) | tylosin 枚举唯一产物 |
+| [validation_output/enumeration/per_scaffold/tylosin/scheme_b_fix_pos13/tylosin_scheme_b_fix_pos13.sqlite](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/enumeration/per_scaffold/tylosin/scheme_b_fix_pos13/tylosin_scheme_b_fix_pos13.sqlite) | tylosin 枚举 provenance 数据库 |
+
+## 数据流总览
+
+```mermaid
+flowchart TD
+    A["data/MacrolactoneDB/ring12_20/temp.csv<br/>11,036 个分子"] --> B["classify_macrocycle()<br/>standard / non-standard / not"]
+    B -->|standard_macrolactone| C["逐个标准大环内酯做 canonical numbering"]
+    B -->|non_standard_macrocycle / not_macrolactone| D["processing_status = skipped"]
+    C --> E["遍历 position > 2 的环位点"]
+    E --> F["collect_fragmentable_side_chain_atoms()<br/>只保留单锚点可拼接侧链"]
+    F -->|None| G["丢弃该裂解尝试"]
+    F -->|atoms returned| H["build_fragment_with_isotope()<br/>生成 labeled / plain SMILES"]
+    H --> I["写入 side_chain_fragments"]
+    H --> J["写入 fragment_library_entries<br/>source_type = validation_extract"]
+    J --> K["fragment_library.csv / fragments.db"]
+    K --> L["按 plain SMILES 计算重原子数"]
+    L --> M["全库阈值分析 + 位点多样性分析"]
+    M --> N["导出 ring16_position_fragment_exports/"]
+    N --> O["tylosin scheme_b_fix_pos13 枚举"]
+```
+
+## 1. 术语与编号规则
+
+| 术语 | 含义 |
+|---|---|
+| `canonical numbering` | `1 = 内酯羰基碳`，`2 = 相邻酯氧`，`3..N` 按从 2 位出发沿环唯一遍历顺序编号 |
+| `mirror mapping` | 16 元环固定镜像关系，`3→16`、`4→15`、`5→14`、`6→13`、`7→12`、`8→11`、`9→10` |
+| `standard_macrolactone` | 只有一个可唯一确认的 12-20 元 lactone 环，且 `3..N` 全部为碳 |
+| `non_standard_macrocycle` | 有重叠候选环，或者 `3..N` 位置出现非碳原子，属于桥环 / 稠环 / 非标准大环 |
+| `not_macrolactone` | 找不到有效的 12-20 元 lactone 环 |
+| `cleavage_position` | 侧链连接到环上的位置编号 |
+| `splice_ready` | 该碎片是单锚点、可直接用于重新拼接的碎片 |
+| `fragment_smiles_plain` | 去掉 isotope 但保留 dummy 原子 `*` 的碎片 SMILES |
+| `fragment_smiles_labeled` | 带 isotope 的碎片 SMILES，例如 `[13*]...` |
+
+这里特别强调一点：碎片去重时考虑了 dummy 原子 `*`，但**不**把 dummy 上的 isotope 作为唯一性依据。也就是说，`*C`、`*O` 这类结构会按 `plain SMILES` 去重，但 `[`13*`]...` 这类位置标签不会把同一 plain 结构拆成多个独立 chemotype。
+
+## 2. 从 `temp.csv` 到标准大环内酯
+
+原始输入文件是 [data/MacrolactoneDB/ring12_20/temp.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/data/MacrolactoneDB/ring12_20/temp.csv)，共 **11,036** 个分子。
+
+### 2.1 分类结果
+
+| 分类 | 数量 | 占总输入比例 |
+|---|---:|---:|
+| `non_standard_macrocycle` | 6,336 | 57.41% |
+| `standard_macrolactone` | 4,482 | 40.61% |
+| `not_macrolactone` | 218 | 1.98% |
+
+这一步的关键不是“有没有大环”本身，而是“是否满足标准大环内酯定义”：
+
+1. 必须存在 12-20 元 lactone 候选环。
+2. 候选环必须唯一，不能是多个重叠候选。
+3. 环上 `3..N` 必须全部是碳。
+
+因此，很多结构虽然是宏环，但会因为桥环、稠环、杂原子插入或候选不唯一而被排除在 `standard_macrolactone` 之外。
+
+### 2.2 标准大环内酯的 ring size 分布
+
+在 **4,482** 个标准大环内酯中，ring size 分布如下：
+
+| ring size | 数量 | 占标准集比例 |
+|---|---:|---:|
+| 12 | 426 | 9.50% |
+| 13 | 198 | 4.42% |
+| 14 | 2,478 | 55.29% |
+| 15 | 43 | 0.96% |
+| 16 | 1,111 | 24.79% |
+| 17 | 42 | 0.94% |
+| 18 | 140 | 3.12% |
+| 19 | 6 | 0.13% |
+| 20 | 38 | 0.85% |
+
+这个分布说明，当前验证集中最主要的标准大环内酯集中在 **14 元环** 和 **16 元环**，其中 14 元环超过一半，16 元环接近四分之一。
+
+### 2.3 为什么 4,482 会进一步变成 4,451
+
+这 4,482 个标准大环内酯里，有 **31 个分子没有任何可拼接侧链碎片**，因此不会进入 `fragment_library.csv`。
+
+换句话说：
+
+| 阶段 | 数量 | 占标准集比例 |
+|---|---:|---:|
+| `standard_macrolactone` 总数 | 4,482 | 100.00% |
+| 至少产生 1 条侧链碎片 | 4,451 | 99.31% |
+| `num_sidechains = 0` | 31 | 0.69% |
+
+这 31 个分子不是“分类失败”，而是“分类成功但没有通过侧链可拼接过滤”。它们的 `cleavage_positions` 为空，说明在 `position > 2` 的环位点上，没有找到满足规则的外侧链。
+
+### 2.4 实际进入碎片库的 ring size 分布
+
+在最终 **4,451** 个 fragment-bearing 母体中，ring size 分布如下：
+
+| ring size | 数量 | 占 fragment-bearing 母体比例 |
+|---|---:|---:|
+| 12 | 422 | 9.48% |
+| 13 | 191 | 4.29% |
+| 14 | 2,475 | 55.61% |
+| 15 | 41 | 0.92% |
+| 16 | 1,105 | 24.83% |
+| 17 | 36 | 0.81% |
+| 18 | 139 | 3.12% |
+| 19 | 4 | 0.09% |
+| 20 | 38 | 0.85% |
+
+这张表才是后续碎片库真正的母体分布，因为它排除了那 31 个“标准但无侧链”的分子。
+
+## 3. 碎片库如何生成
+
+碎片库的生成逻辑在验证流程中完成，结果写入：
+
+| 输出 | 含义 |
+|---|---|
+| [validation_output/fragment_library.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library.csv) | 统一碎片库导出 |
+| [validation_output/fragments.db](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragments.db) | `parent_molecules`、`side_chain_fragments`、`fragment_library_entries` 等表 |
+
+对每个 `standard_macrolactone`，程序会：
+
+1. 先做 canonical numbering。
+2. 只遍历 `position > 2` 的位点。
+3. 跳过环内原子和 intrinsic lactone neighbor。
+4. 用 `collect_fragmentable_side_chain_atoms()` 识别单锚点、可拼接侧链。
+5. 用 `build_fragment_with_isotope()` 生成 `fragment_smiles_labeled` 和 `fragment_smiles_plain`。
+6. 只有 `Chem.MolFromSmiles(plain_smiles)` 可解析时，碎片才会写入数据库和 CSV。
+
+因此，这份库并不是“把所有侧链都随意裂开”，而是“只保留单锚点、可重拼接、SMILES 合法的侧链碎片”。
+
+## 4. 统一碎片库的规模与去重
+
+`fragment_library.csv` 的核心统计如下：
+
+| 指标 | 数值 |
+|---|---:|
+| 行数 | 34,829 |
+| 去重母体数 | 4,451 |
+| 唯一 `fragment_smiles_plain` 数 | 1,852 |
+| 唯一 `fragment_smiles_labeled` 数 | 2,051 |
+
+这里最容易误解的一点是：`1,852` 不是“把 dummy 原子去掉以后才算出来的”，而是按 `fragment_smiles_plain` 去重得到的。`plain` 仍然保留 dummy 原子 `*`，只是去掉了 isotope 标签，因此：
+
+1. `*C` 和 `*O` 这样的结构会被当成不同碎片。
+2. `[13*]C` 和 `[16*]C` 会因为 isotope 标签被抹掉而收敛成同一个 plain 结构。
+
+换言之，`1,852` 说明的是“**去掉位置标签后的 chemotype 数量**”，而不是“把 dummy 原子也删掉后的数量”。
+
+### 4.1 高频碎片
+
+当前库里最常见的 plain 碎片是：
+
+| 碎片 | 计数 | 占总行数比例 |
+|---|---:|---:|
+| `*C` | 15,927 | 45.73% |
+| `*O` | 4,722 | 13.56% |
+| `*=O` | 3,167 | 9.09% |
+| `*CC` | 2,261 | 6.49% |
+
+这四类最简单的碎片合计已经占到总行数的绝大部分。它们非常适合解释为什么后续要使用 `>3` 重原子作为设计相关下限，因为库里真正占量的是大量一到三原子的“噪声型”片段，而不是高信息密度的大碎片。
+
+### 4.2 为何 `1852` 仍然不算“小”
+
+`34,829` 条行数去重后剩 `1,852` 个 unique plain SMILES，并不反常，原因是：
+
+1. 很多碎片在不同母体、不同位置上会重复出现。
+2. 小碎片的复用率极高，尤其是 `*C`、`*O`、`*=O`、`*CC` 这类。
+3. 只要保留 dummy 原子 `*`，就会把“裸碎片”与“带连接点的片段”区分开来，因此 unique 数不会无限压缩。
+
+## 5. 侧链筛选阈值：为什么下限是 `>3` 重原子
+
+关于你关心的“上限和下限”：
+
+1. **下限是明确的**：后续设计相关侧链分析采用 `>3` 重原子。
+2. **上限不是硬编码规则**：当前代码和报告没有设置统一的碎片上限。
+3. **如果问当前库的经验上沿**：`fragment_atom_count_summary.csv` 显示最大重原子数是 **48**，`p95 = 14`，`p99 = 27`。
+
+### 5.1 结果文件位置
+
+如果你要找“上限是多少”的依据，应该看这几个文件：
+
+| 文件 | 作用 |
+|---|---|
+| [fragment_atom_count_summary.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library_analysis/fragment_atom_count_summary.csv) | 给出 `max_atom_count = 48`、`p95 = 14`、`p99 = 27` 等摘要 |
+| [fragment_atom_count_frequency.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library_analysis/fragment_atom_count_frequency.csv) | 给出每个原子数的频次分布 |
+| [fragment_atom_count_filter_candidates.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library_analysis/fragment_atom_count_filter_candidates.csv) | 给出不同下限阈值的删减效果 |
+| [analysis_summary.txt](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library_analysis/analysis_summary.txt) | 文字版摘要，最适合快速引用 |
+
+### 5.2 为什么下限选 `>3`
+
+阈值候选表显示：
+
+| 下限规则 | 删除行数 | 删除行比例 | 删除 unique fragments |
+|---|---:|---:|---:|
+| `<=1` | 23,994 | 68.89% | 10 |
+| `<=2` | 28,069 | 80.59% | 26 |
+| `<=3` | 28,550 | 81.97% | 52 |
+| `<=4` | 29,045 | 83.39% | 88 |
+| `<=5` | 29,272 | 84.04% | 141 |
+
+这组数据给出的结论非常清楚：
+
+1. `<=3` 已经去掉了 **82%** 左右的记录。
+2. 但它只去掉了 **2.8%** 的 unique fragments。
+3. 换句话说，低于等于 3 重原子的碎片主要贡献的是“行数噪声”，不是“结构多样性”。
+
+所以，`>3` 是一个很自然的设计相关下限，因为它把大量单原子、双原子、三原子碎片排除掉，同时尽可能保留更像“真实取代基”的片段。
+
+### 5.3 上限为什么不设成硬规则
+
+当前库的重原子数分布是长尾的，最大值到 48，但：
+
+1. 大于 14 的片段已经属于少数。
+2. 大于 27 的片段更是极少。
+3. 这些长尾片段中仍可能包含糖环、杂环、稠环等有意义的单锚点片段。
+
+因此，当前项目更适合把上限当作“任务依赖的经验裁剪”，而不是“全局硬上限”。
+
+如果你必须写一个论文里的操作性描述，可以这样写：
+
+> 本研究采用 `>3` 重原子作为设计相关侧链下限；上限不做全局硬截断，仅在具体下游任务中按库规模与化学可解释性进行任务特异性裁剪。当前库的经验分布显示重原子数最大为 48，95% 分位数为 14，99% 分位数为 27。
+
+这个表述比“固定上限 = 某个整数”更稳妥，也更符合当前代码和数据实际。
+
+## 6. 16 元环的位点碎片提取
+
+16 元环是本项目里最重要的 ring size 之一，后续位点导出固定在 canonical 位置 `3/4/12/13`。
+
+### 6.1 位点导出数量
+
+`validation_output/ring16_position_fragment_exports/` 下四个导出文件的 unique fragment 数量如下：
+
+| 位点 | unique fragment 数 |
+|---|---:|
+| 3 | 121 |
+| 4 | 70 |
+| 12 | 99 |
+| 13 | 198 |
+
+所以，你前面问的“3、4、12 位置是不是 121、70、99？”答案是：**对，正确**。如果把 13 位也算上，那么 13 位是 **198** 条 unique fragments。
+
+### 6.2 对应的全量与设计相关子集
+
+| 位点 | 全量碎片数 | unique plain SMILES | `>3` 重原子后碎片数 | `>3` unique plain SMILES |
+|---|---:|---:|---:|---:|
+| 3 | 1,048 | 121 | 269 | 117 |
+| 4 | 595 | 70 | 269 | 63 |
+| 12 | 930 | 99 | 177 | 83 |
+| 13 | 876 | 198 | 709 | 193 |
+
+这说明：
+
+1. 13 位在天然库里最丰富。
+2. 3 位和 4 位的 unique chemotype 也不低。
+3. 12 位虽然总量不如 13 位，但设计相关子集仍然相当可观。
+
+### 6.3 位置编号与文献标签的关系
+
+由于项目统一使用 canonical numbering，16 元环的这四个位点在文献视角下可以理解为镜像位置：
+
+| canonical position | literature-style mirrored label |
+|---|---|
+| 3 | 16 |
+| 4 | 15 |
+| 12 | 7 |
+| 13 | 6 |
+
+因此，当前数据里最富集的 canonical 位点 `13, 3, 4, 12`，对应文献常说的 `6, 16, 15, 7` 一组方向镜像标签。
+
+## 7. tylosin 的枚举结果
+
+本项目里 tylosin 的枚举结果保存在：
+
+| 文件 | 含义 |
+|---|---|
+| [validation_output/enumeration/per_scaffold/tylosin/scheme_b_fix_pos13/tylosin_scheme_b_unique_products.csv](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/enumeration/per_scaffold/tylosin/scheme_b_fix_pos13/tylosin_scheme_b_unique_products.csv) | 唯一产物表 |
+| [validation_output/enumeration/per_scaffold/tylosin/scheme_b_fix_pos13/tylosin_scheme_b_fix_pos13.sqlite](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/enumeration/per_scaffold/tylosin/scheme_b_fix_pos13/tylosin_scheme_b_fix_pos13.sqlite) | 组合 provenance 与运行元数据 |
+| [validation_output/enumeration/per_scaffold/tylosin/scheme_b_fix_pos13/README.md](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/enumeration/per_scaffold/tylosin/scheme_b_fix_pos13/README.md) | 运行说明 |
+
+### 7.1 枚举设定
+
+该结果对应 `scheme_b_fix_pos13`，核心设定是：
+
+| 参数 | 值 |
+|---|---:|
+| `reference_slug` | `tylosin` |
+| `replace_positions` | `[3, 4, 12, 13]` |
+| `fixed_positions` | `[13]` |
+| `candidate_counts` | `{3: 121, 4: 70, 12: 99}` |
+
+这意味着：
+
+1. 13 位的糖基保持不变。
+2. 只对 3、4、12 位进行枚举。
+3. 拼接空间是这三个位点片段库的笛卡尔积。
+
+### 7.2 枚举规模
+
+| 指标 | 数值 |
+|---|---:|
+| 尝试组合数 | 838,530 |
+| 成功拼接数 | 838,530 |
+| 去重后唯一产物数 | 810,810 |
+| 合并掉的重复组合数 | 27,720 |
+| 重复率 | 3.31% |
+
+这里最关键的一点是：
+
+`838,530 = 121 × 70 × 99`
+
+所以原始组合数就是 3 个位点片段库的直积。去重后变成 810,810，说明有一小部分不同组合最终坍缩成了同一个 canonical product SMILES。
+
+### 7.3 唯一产物分布
+
+`occurrence_count` 的分布是：
+
+| occurrence_count | 唯一产物数 |
+|---|---:|
+| 1 | 790,020 |
+| 2 | 13,860 |
+| 3 | 6,930 |
+
+这说明大多数 unique product 都只对应单一路径，但也有一部分产物由多个组合收敛而来。
+
+## 8. 可以直接写进论文的结论
+
+### 8.1 验证与碎片库生成
+
+在 MacrolactoneDB `ring12_20` 验证集中，11,036 个输入分子经分类后得到 4,482 个 `standard_macrolactone`，其中 31 个标准大环没有任何可拼接侧链碎片，最终形成 4,451 个 fragment-bearing 母体和 34,829 条可拼接碎片记录。
+
+### 8.2 侧链筛选阈值
+
+碎片大小分布极度右偏，`*C`、`*O`、`*=O`、`*CC` 四类最简单碎片已占据绝大多数记录。基于当前库的频率分布，建议将 `>3` 重原子作为后续设计相关侧链的下限；同时，当前库没有全局硬上限，最高观察值为 48 重原子，95% 分位数为 14，99% 分位数为 27。
+
+### 8.3 16 元环位点
+
+在 canonical 16 元环编号下，`3/4/12/13` 位导出的 unique fragments 数分别为 121、70、99、198。若按文献镜像标签表达，则对应 `16/15/7/6` 位。
+
+### 8.4 tylosin 枚举
+
+以 tylosin 为参考骨架、固定 13 位糖基不变时，`3/4/12` 位枚举共产生 838,530 个组合，去重后得到 810,810 个 unique products，重复折叠率为 3.31%。
+
+## 9. 推荐的图表引用
+
+| 图 | 文件 |
+|---|---|
+| 全库碎片原子数分布 | [fragment_atom_count_distribution.png](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library_analysis/fragment_atom_count_distribution.png) |
+| 16 元环位点数量对比 | [ring16_position_count_comparison.png](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library_analysis/ring16_position_count_comparison.png) |
+| 16 元环设计相关碎片 boxplot | [ring16_position_atom_count_boxplot_gt3.png](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library_analysis/ring16_position_atom_count_boxplot_gt3.png) |
+| 16 元环位点多样性图 | [ring16_position_diversity_gt3.png](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library_analysis/ring16_position_diversity_gt3.png) |
+| 16 元环药化热点对比 | [ring16_medchem_hotspot_comparison.png](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library_analysis/ring16_medchem_hotspot_comparison.png) |
+| 16 元环环状侧链敏感性 | [ring16_position_ring_sensitivity.png](/Users/lingyuzeng/project/macro_split/validation_output/fragment_library_analysis/ring16_position_ring_sensitivity.png) |
+
+## 10. 一句话总结
+
+这条链路的核心结论是：`temp.csv` 中 11,036 个分子经过标准大环内酯筛选后，真正进入可拼接碎片库的是 4,451 个母体、34,829 条碎片；碎片大小分布强烈偏向 1-3 重原子小片段，因此后续设计分析采用 `>3` 重原子作为下限，而 16 元环的 3、4、12、13 位碎片与 tylosin 的 fixed-pos13 枚举结果一起构成了后续论文中最重要的参数和设计依据。